Aunque al iniciarse el Quinientos el Puerto de Sevilla había ya alcanzado un notable relieve, especialmente por el tráfico de productos de sus riberas, es el Descubrimiento de América el que lo convierte en ese puerto universal y escala obligada en la ruta del Viejo al Nuevo Continente.
El puerto sevillano pasó a ser el principal puerto de enlace con América, manteniendo un monopolio absoluto como vía de entrada y salida de las Indias mediante un asiento otorgado por Real Decreto. Ello justifica el establecimiento de la Casa de la Contratación en Sevilla en 1503, que tendrá la exclusividad de la Carrera de Indias.
La elección de un puerto fluvial como el de Sevilla frente a un puerto de mar responde a varias razones. La costa de Huelva caía fuera de las principales rutas terrestres de comunicación con el resto de España, era la periferia. Además en Huelva abundaban las tierras de señorío y, desde luego, la Corona no estaba dispuesta compartir su poder con nadie. En la costa de Cádiz, Sanlúcar de Barrameda carecía de puerto abrigado y Cádiz, que con su bahía podía haber sido perfectamente Puerto de Indias (lo fue dos siglos más tarde) en los primeros años del siglo XVI era una ciudad pequeña, casi aislada de la península y expuesta a los ataques por mar. En definitiva, no eran seguros. En cambio, Sevilla era un puerto interior, a sólo 100 kilómetros del mar y por tanto más protegido de los ataques del exterior e incluso del contrabando. Además, Sevilla tenía experiencia como puerto comercial desde la antigüedad. Por tanto, una magnífica situación estratégica que convertirá al puerto de Sevilla en puerto universal. Los únicos inconvenientes que presentaba era el sinuoso trazado del Guadalquivir hasta Sevilla, atravesando marismas con poca profundidad, que no permitía buques de gran tonelaje, y la barra de arena de Sanlúcar, que obligaba a los barcos a maniobrar con sumo cuidado y no demasiado peso. Más de uno naufragó en dicha zona, una de las razones por las que el Puerto de Indias se iría trasladando poco a poco a Cádiz, hasta la pérdida del Monopolio de la Carrera de Indias en 1717, año en el que Felipe V ordenó que la Casa de la Contratación se trasladase a Cádiz.
En esta época el puerto se encontraba situado en el Arenal, una explanada que se extendía entre las murallas y la orilla izquierda del Guadalquivir, entre la Puerta de Triana y la Torre del Oro. En el siglo XVI las mercancías traídas de las Indias eran almacenadas en las Atarazanas y existía una Aduana que ocupaba alguna de sus naves. La Casa de la Contratación de Indias se encontraba en los Reales Alcázares y la Lonja de Mercaderes, también llamada Consulado o Universidad de Mercaderes o Consulado de Cargadores a Indias pasó a colocarse en un edificio que, desde el siglo XVIII, alberga el Archivo de Indias, próximo a la Catedral.